骨肉瘤（ostesarcoma，OS） 是青少年中第三常见的癌症，15 岁以下儿童的年发病率为5.6/100万[1]。微小残留疾病的存在，可导致大面积手术切除后癌症复发转移，是癌症患者死亡的首要原因。这些残留癌细胞的进展取决于围手术期多种协同的因素，其中包括麻醉技术及药物对肿瘤复发转移的影响。七氟烷对骨肉瘤的作用尚未阐明。笔者旨在探讨七氟烷对骨肉瘤Saos2 细胞的影响，以尽可能减少麻醉相关的肿瘤复发转移。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤细胞株（Saos2 细胞）：购自昆明江宗生物科技有限公司，由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室提供。胎牛血清：购自BIOSHARP 公司，RPMI1640 培养基、cck-8 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。七氟烷购自江苏恒瑞医药有限公司。划痕实验采用ibidi 伤口愈合与细胞迁移插件。

1.2 细胞培养方法与分组

向人骨肉瘤Saos2 细胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，置于37℃、5%CO2培养箱，取出处于对数期生长的Saos2 细胞，配制成1×106cell/mL 细胞悬液，接种于细胞培养板中，分别标记为对照组（Control 组）、1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组。将要处理的Saos2 细胞放置于特制无菌密闭容器中，密闭容器进气口与七氟烷麻醉机连接，出气口与气体分析仪连接；对照组以相同流量的无菌过滤氧气处理。每组处理相同时间各2 h，七氟烷处理完毕后，于密闭容器中取出细胞继续培养24 h，以供进行增殖、侵袭、迁移及凋亡能力的测定。

1.3 细胞增殖率检测

采用cck-8 法%胰酶消化收集细胞，接种至96 孔板内，每孔接种2500 个细胞，空白孔内只加入培养基和cck-8 溶液。过夜培养后按照实验分组做对应处理。处理结束后24 h 每孔加入10 μL cck-8 试剂，培养箱内孵育2 h 后酶标仪450nm 波长下检测吸光度（OD 值）。

1.4 细胞侵袭能力观察

采用Transwell 小室实验。在上下室之间铺上适宜浓度的基质胶。取对数期生长的Saos2 细胞，进行消化、离心配制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105cell/mL，每孔上室加入细胞悬液100 μL，下室加入500 μL 含FBS 培养液，接种后不同浓度七氟烷作用2 h 后培养箱内培养24 h。经固定、染色、清洗后100 倍镜下观察拍照。每个小室随机选取5 个视野，拍照并计数细胞数量。

1.5 划痕伤口愈合实验

0.25 %胰酶消化收集细胞，调整悬液浓度为2.5×104/mL，往ibidi 插件的左右孔中各加入100 μL 的细胞悬液。培养箱内培养至融合度达到90%～100%，小心的用镊子将伤口愈合插件拔出，用基础培养基清洗一次细胞，加入MEM 基础培养基，不同浓度七氟烷作用2 h 后培养箱内培养，于0 h、12 h 观察伤口愈合情况。采用ImageJ 图片分析软件计算划痕愈合率。

1.6 细胞凋亡实验

0.25 %胰酶消化收集细胞，接种至6 孔板内，每孔接种105个细胞。当细胞融合度达到70%左右时更换为MEM基础培养基，不同浓度七氟烷作用2 h，培养箱内培养24 h 后，用0.25 胰酶消化收集细胞，PBS 清洗两次。用100 μL 流式凋亡结合缓冲液重悬细胞，每管加入5 μL Annexin V 混匀，室温避光孵育10 min。随后每管加入5 μL PI 避光孵育5 min，用PBS 将液体补至1 mL 后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 统计学处理

采用Graph pad8.0 统计软件处理数据。计量资料服从正态分布以均数±标准差描述，组间比较采用单因素方差分析，有差异用Dunnettt检验与对照组比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cck-8 细胞增殖率检测结果

对照组和1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组的细胞增殖率分别为 100%、91.72%%、86.36% %、81.97% %，七氟烷组细胞增殖率均低于对照组（P＜0.05）），且随着七氟烷浓度的增加，抑制增殖作用增强，见图1。

2.2 Transwell 小室细胞侵袭能力的比较

对照组和1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组穿膜细胞数分别为（105.）、（68.）、（59.）、（36.）个。七氟烷组穿膜细胞数较对照组均减少（P＜0.05），表明随着浓度的增加，七氟烷抑制侵袭作用增强，见图2～3。

图1 各组Saos2 细胞增殖率的比较Fig.1 Comparison of the ratio proliferation of Saos2 cells among different groups与对照组比较，**P＜0.05。

图2 各组Saos2 细胞侵袭能力的比较Fig.2 Comparison of the invasion of Saos2 cells among different groups与对照组比较，**P＜0.05。

上一篇：七氟醚通过靶向调控通路抑制结直肠癌细胞的迁
下一篇：没有了