结直肠癌(CRC)是全球范围内最常见的具有高转移性的恶性肿瘤之一。七氟醚是1种挥发性麻醉剂，据报道其在非小细胞肺癌和肾癌的转移中具有重要的调控作用[1]。microRNAs(miRNAs)是一类具有21～25个核苷酸的小型非编码RNA，它们对CRC的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程具有重要的作用。此外，研究发现miRNAs参与多种癌症中七氟醚介导的生物学过程。如miR-637通过调节蛋白激酶B途径介导七氟醚对神经胶质瘤细胞迁移和侵袭的作用[2]。miR-203作为一种肿瘤抑制因子，可调控非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭[3]，而且miR-203也介导七氟醚对乳腺癌细胞增殖的调控[4]。本文旨在研究七氟醚对CRC细胞迁移和侵袭的影响，并探讨miR-203在其中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及干预方式

人CRC细胞系SW620购自美国ATCC公司。将细胞培养在含有10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，与37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养，待细胞汇合度达到90%以上时，进行传代培养，每隔2～3天换一次培养基。取第3～5代生长稳定的细胞用于后续试验。

将细胞以每孔5×105个细胞(1 ml/孔，5×105/ml)接种于6孔板中，培养24 h后，随机分为2组：对照组和七氟醚组，n=4。将培养板置于密闭容器中，于37 ℃恒温水浴锅中，密闭容器进气口连接麻醉机，通入气体。采用气体检测仪监测通入七氟醚的浓度。七氟醚组通入4%的七氟醚、5% CO2～95% O2，对照组通入5% CO2～95% O2，气体流量均为1 μl/min，持续通入6 h。然后细胞在进行常规培养24 h。

1.2 划痕实验

将2组处理后的细胞制备成细胞悬液并计数，以1×106个/皿的浓度将细胞接种于60 mm的小皿中，培养过夜。用无菌的200 μl的枪头在垂直于细胞生长方向划痕，用预冷的PBS洗3次，继续于37 ℃培养48 h后，在倒置显微镜下拍照。计算迁移速率(m/h)=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/48 h。

1.3 Transwell细胞侵袭实验

将用无血清培养基配制的Matrigel胶预先平铺于Transwell上、下小室之间。将2组处理好的细胞用无血清培养基制备成细胞悬液并计数。取2×105/ml个细胞200 μl加入Transwell上小室中，下小室中充满含20%胎牛血清的培养基，于37 ℃培养24 h后，用4%多聚甲醛室温固定20 min，0.1%结晶紫室温染色20 min，200光镜下计数，随机选取10个视野，统计细胞数。

1.4 Western Blot

采用RIPA裂解液从各组细胞中提取总蛋白，BCA试剂盒进行总蛋白定量分析。将20 g的总蛋白加入上样缓冲液，用10%的SDS-PAGE凝胶分离，转膜至PVDF膜上，用5%的胎牛血清封闭45 min，于4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗3次，室温摇床孵育二抗1 h，TBST洗3次，用电化学发光试剂ECL暗室发光。采用凝胶成像系统和Image J软件统计分析条带。β-actin为内参，p-ERK、ERK、β-actin抗体及二抗均购自上海碧云天公司，MMP-9、Robo1抗体购自美国Abcam公司。

1.5 实时荧光定量PCR

采用TriZol试剂从各组细胞中提取总RNA，用M-MLV反转录酶合成第一链cDNA，用SYBR green荧光染料进行定量PCR扩增。根据2-Ct公式计算目的基因的相对表达量，miR-203的内参用U6，Robo1的内参用β-actin。引物由Primer designing tool软件设计，由上海生工生物工程公司合成。

1.6 统计学分析

所有数据均采用表示，数据均应用SPSS 22.0软件进行统计分析。2组间对比采用t检验。P<0.05表示差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 七氟醚对CRC细胞迁移能力的影响

如图1所示，七氟醚组的细胞迁移速率(7.)m/h显著低于对照组的细胞迁移速率(4.)m/h。

图1 2组细胞迁移能力对比

2.2 七氟醚对CRC细胞侵袭的影响

如图2所示，七氟醚组穿透Matrigel基质胶的细胞数[(95.)个]，显著低于对照组[(48.)个]。

2.3 七氟醚对CRC细胞ERK/MMP-9通路的影响

如表1所示，与对照组相比，七氟醚组p-ERK和MMP-9的表达显著降低(P<0.05)，而七氟醚组ERK的表达无显著变化。

2.4 七氟醚对CRC细胞miR-203及其靶基因的影响

如图3所示，根据TargetScan在线软件的预测结果，miR-203可与Robo1 3’UTR端结合，且在Robo1 3’UTR端有2个结合位点550～557和1441～1448。如表2所示，qRT-PCR及Western Blot结果显示，与对照组相比，七氟醚组miR-203的表达显著增加(P<0.05)，而Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

图2 2组细胞侵袭能力对比

表1 2组ERK/MMP-9通路分子表达对比组别p-ERKERKMMP-9对照组七氟醚组

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