喉癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，相当一部分晚期喉癌的5 年生存率仅有大概51%[1]。 微小RNA（MicroRNA，miRNA） 是当前研究热点和前沿之一[2]。miRNA 可通过调节下游基因的表达和功能参与生命活动的调节，如凋亡、增殖及分化，发挥类似癌基因或抑癌基因的作用[3-5]。 最新研究显示，miRNA-29c 表达异常减少是导致一些恶性肿瘤细胞无限增殖及肿瘤发生、发展的重要因素[6-8]。 但暂时未见与喉癌的相关的报道。 本研究检测miRNA-29c 在喉癌及癌旁组织中的表达，并探讨其与临床病理特征的关系及对肿瘤预后的影响。 此外以喉癌细胞系Hep-2 为研究对象，瞬时转染技术提高了Hep-2 细胞中miRNA-29c 的表达水平，观察miRNA-29c 对喉癌Hep-2 细胞增殖和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取 2006 年 1 月～2016 年 12 月在我院耳鼻喉科经手术切除的喉癌患者的蜡块标本86 例作为喉癌实验组，同时，将42 例石蜡包埋的癌旁正常喉黏膜上皮组织作为对照组。 86 例喉癌患者中，男79 例，女7 例，年龄 47～82 岁，平均（62.）岁，所有患者在手术前均未接受放化疗或其他治疗。

1.2 细胞及试剂

人喉鳞Hep-2 细胞株购买于中国科学院上海细胞研究所。 RPMI-1640 培养基及胎牛血清（Gibco 公司），CCK-8 试剂盒（Bryotime 公司），核糖核酸试剂盒Trizol 及细胞转染试剂 Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；Real MasterMix（SYBR Green）荧光定量PCR 试剂盒 （Tiangen 公司）；Transwell 小室 （Corning公司）；Matrigel Basement Membrane Matrix（BD 公司）；miRNA-29c 模拟物（miRNA-29c mimics）及无关序列（negetive control，NC）由 Ribobio 合成。

1.3 方法

1.3.1 Hep-2 细胞培养 将人喉癌Hep-2 细胞接种于6 孔板，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基进行培养，条件是37℃、含5% CO2。 实验分为三组：miNRA-29c mimics 组（miRNA-29c 模拟物+Lipo2000）；NC 组（NC+ Lipo2000）；mock 组（正常空白对照）。

1.3.2 细胞转染并检测转染效率 待Hep-2 细胞株的生长密度达到约80%时，根据LipofectamineTM2000的操作说明书，使用Lipo 2000 分别将miRNA-29c 模拟物和无关序列NC 转染至Hep-2 细胞。 转染Cy3-NC 24 h 后，利用荧光显微镜观察转染效率并拍照。

1.3.3 Q-RT-PCR 用于检测喉癌标本及癌旁组织中mRNA-29c 的表达量 将每个蜡块样品切成10 μm厚的切片，并取5 个切片提取总RNA。 根据Trizol 说明书的方法，进行细胞的总RNA 的提取，并利用紫外分光光度计测A260/A280。通过逆转录合成cDNA，并将合成的cDNA 稀释10 倍。 按如下条件进行PCR 反应：预变性 95℃ 30 s，变形 95℃ 5 s，退火延伸 60℃30 s， 扩增 40 个循环。 记录每个孔的 CT 值， 并取 3个孔的平均值作为结果，以U6 为内参基因，并采用2-△△Ct 法计算miRNA-29c 的相对表达量，每个样本独立重复实验3 次。

1.3.4 Q-RT-PCR 检测 3 组细胞中 mRNA-29c 的表达量 将每组Hep-2 细胞转染48 h，按照Trizol 说明书方法提取细胞总RNA，具体实验步骤同1.3.3。 miRNA-29c 和U6 引物序列见表1。

表1 miRNA-29c 和 U6 引物序列名称 引物序列（5’→3’）miRNA-29c U6上游引物：CTGACCTTAGCACCATTTGAAATC下游引物： TATCGTTGTACTCCACTCCTTGAC上游引物：ATTGGAACGATACAGAGAAGATT下游引物：GGAACGCTTCACGAATTTG

1.3.5 CCK-8 检测Hep-2 细胞增殖能力的变化 在不同的96 孔上接种细胞悬液，均设5 个重复孔，再进行细胞转染。 培养48 h 后于每孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定每孔的吸光值（A 值），检测波长为 450 nm，A 值越高，表明活细胞数越多，细胞增殖活性也就越高。

1.3.6 Transwell 法检测Hep-2 细胞侵袭能力的变化Matrigel 基质胶利用无血清1640 培养基稀释，浓度为50 mg/L，以 50 μL 的体积加入 Transwell 小室的上室。37℃放置 30 min。分别将 3 组细胞（2.0×105个/L）的悬液200 μL 加入Transwell 细胞培养小室的上室， 置于37℃、5%CO2孵箱培养24 %结晶紫染色30 min，自来水洗净后，用湿棉试子除去聚碳酸酯膜上表面的细胞，在倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞。最后，在33%醋酸中洗涤细胞小室，利用紫外分光光度测量570 nm 处的A 值，独立重复实验3 次，取平均?统计学处理

统计分析利用 SPSS19.0 软件，GraphPad Prims 8.0 软件绘制统计图。 计量资料以均数±标准差（）表示，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-29c 在喉癌组织及癌旁组织中的表达情况

Q-RT-PCR 结果显示，miRNA-29c 在喉癌组织及癌旁正常喉黏膜上皮组织中的表达水平分别为（0.）、（0.），miRNA-29c 在喉癌组织中的表达明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（t=13.96，P

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