骨肉瘤（osteosarcoma，OS）发病年龄轻，致死率高[1-2]，易转移[3]。手术和化疗虽有一定效果，但死亡率和转移率仍然居高不下[4-5]。因此，阐明OS 的侵袭机制，寻找生物标志物，至关重要。非编码RNA 在肿瘤的发展中占据重要地位[6]。长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）包含200 个以上核苷酸，从表观遗传学、转录和转录后调控等层面参与生物体的调控过程[7-9]，并通过多种机制影响基因和蛋白的表达[10-12]。本研究发现lncRNA ROR1-AS1 在OS 中过表达，并探讨其在OS 细胞侵袭中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人成骨细胞NHOst 和人OS 细胞株HOS、Saos-2、U20S 和MG63（购自ATCC）。胎牛血清（TBD，中国）、DMEM 培养基（Gibico，美国），无菌培养箱（Thermo，美国）；lncRNA ROR1-AS1 的si-RNA 慢病毒、对照病毒、ROR1 过表达质粒，定量引物（Genechem，中国）；PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，中国]，SYRB Green 染料（Invitrogen，美国，S7563）及逆转录试剂盒（TakaRa，日本，RR037A）。Transwell 小室（Corning，美国），稀释基质胶（BD，美国），Lipofectamine 2000 （Invitrogen，美国，），PCR 仪（ROCHE，瑞士）；抗体ROR1，E-caderin，N-caderin，抗体（ab cam，美国，ab、ab76 055、ab，1∶400）。

1.2 细胞培养

含10%胎牛血清的DMEM 培养基（含青链霉素）培养细胞，克隆至70%～80%更换培养基；培养箱条件：37℃、50 mL/L CO2。

1.3 RT-PCR

检测各细胞株中lncRNA ROR1-AS1 的表达。TRIzol 法提总RNA，并检测纯度及浓度。依据TaKaRa公司说明书进行逆转录和PCR 反应。反应体系20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL；上、下游引物各0.4 μL；cDNA 5 μL；双蒸水4.2 μL。设定程序为两步法RTPCR：预变性95℃，1 min；之后每一步变性95℃，5 s；退火延伸60℃，20 s；共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。lncRNA ROR1-AS1 的上游引物序列为5′-CTGACGAAACACTGGAACTC-3′，下游引物序列为5′-GTCTGATTTGGTAGCTTGGATG-3′；ROR1 的上游引物序列为5′-CAGATGAGTATGAAGAAGATGG-3′，下游引物序列为5′-ATGGCGAAC-TGAGAACAC-3′；U6 作为内参进行相对定量，U6 的上游引物序列为5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′，下游引物序列为5′-CACTATTGCGGGCTGC-3′。采用2-△△Ct法计算两者的相对表达量，重复3 次。

1.4 细胞转染

依据基因转染操作手册，采用Lipofectamine 2000 将过表达和沉默载体（si-lncRNA ROR1-AS1#1，si-lncRNA ROR1-AS1#2）转染进入细胞。经48 h转染后，观察细胞生长情况，收集细胞用于进一步研究。

1.5 Transwell

37℃无菌条件下，50 μg 细胞外基质（ECM）胶加入8 μm 孔径的Transwell 小室，放置6 h 进行包被；ECM 胶充分凝固后，于上室加入不含抗生素及血清的培养基，接种细胞2×105个/孔，下室加入含10%血清无抗生素的培养基；24 h 后取出小室，无菌棉签擦拭去除上室内的细胞，1%结晶紫染液对小室多孔膜下表面的细胞染色，拍照，计数。染色的细胞穿膜越多，代表侵袭能力越强。

1.6 划痕试验

细胞接种于6 孔板，垂直于孔板采用100 μL 枪头制作细胞划痕，确保各个划痕宽度基本一致。去除培养液，PBS 冲洗孔板，去除细胞碎片。加入不含血清培养基，拍照记录。培养板置入培养箱24 h 后，再分别拍照记录，计算划痕距离百分比。

1.7 Western-blot

提取细胞总蛋白，制备8%聚丙烯酰胺凝胶，每孔20 μg 上样；80 V 积层胶，120 V 分离胶进行电 泳，100 V 转膜90 min，5% BSA 封闭PVDF 膜1 h，加一抗，4℃振荡过夜。TBST 洗涤后滴加二抗，37℃孵育1 h，显影成像。特异性条带净灰度值由Image J 软件获取。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA ROR1-AS1 和ROR1 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中的表达情况

RT-PCR 显示，与NHOst 比较，lncRNA ROR1-AS1和ROR1 在HOS、MG63、U20S、Saos-2 中表达明显升高（P ＜0.01）。见图1。

图1 lncRNA ROR1-AS1 和ROR1 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中的表达情况A.lncRNA ROR1-AS1 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中表达差异； 在人正常成骨细胞和人OS 细胞株中表达差异。与NHOst 比较，**P ＜0.01。OS：骨内瘤

2.2 抑制lncRNA ROR1-AS1 表达后lncRNA ROR1-AS1 和ROR1 表达变化

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