我国是肝癌大国，年发病率和死亡率占全球近一半，且随着环境污染与生活方式的改变，其发病率仍在逐年攀升，形势不容乐观。尽管随着医疗技术的发展，肝癌的治疗方式得到了极大扩展，但目前患者总体生存率仍未取得较大改善[1-2]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是我国肝癌发病的常见病因之一，肝癌患者HBV病毒阳性率达70%~80%[3]。因而，阐明HBV相关肝癌发病的分子机理具有重大的临床意义。

线粒体在细胞代谢调控中均发挥重要作用。此外，线粒体调控细胞凋亡、氧化还原与钙离子稳态等多个细胞生物学过程[4-7]。线粒体是细胞内多拷贝的细胞器，线粒体并非相互独立静态的存在于细胞中，而是时时刻刻通过分裂与融合进行着物质与信息的交流。分裂与融合稳态是线粒体各项功能发挥的前提[8]。研究表明，线粒体分裂与融合失稳态与神经退行性疾病[9]、心血管疾病[10]及糖尿病[11]等的发生与进展高度相关[12-14]。近些年，多种恶性肿瘤中的研究也表明，肿瘤细胞的线粒体分裂常被异常激活，激活的线粒体分裂可进一步通过一系列代谢与凋亡等想你好促进肿瘤进展[15-17]。然而，肿瘤细胞线粒体分裂被激活的分子机制仍不十分明确，有待进一步深入研究。线粒体分裂蛋白MiD51是近几年被鉴定出参与线粒体分裂调控的重要蛋白[18-19]，而其在肿瘤包括肝癌转移中的作用尚不明确。

基于以上分析，本研究首先用qRT-PCR与Western blot实验，对5对HBV阳性肝癌原发灶组织与转移灶组织中MiD51表达进行检测，随后又利用免疫组化实验对另外10对肝癌原发灶与转移灶组织中的MiD51的表达进行检测，以明确肝癌转移过程中MiD51的表达是否存在变化。其次，利用小干扰RNA(siRNA)下调MiD51表达后，分别用细胞划痕与Transwell实验分析MiD51在肝癌细胞迁移与侵袭的影响，从而探讨MiD51对肝癌转移的影响。

1 资料与方法

1.1 肝癌细胞与肝癌组织标本

1.1.1 肝癌细胞系 人HBV阳性肝癌细胞系SNU-368购自中国科学院上海细胞所，细胞于含10%胎牛血清(Hycolon)的RPMI-1640培养液中常规培养(培养条件为37℃、5%浓度的CO2)。

1.1.2 肝癌组织标本 共收集15对肝癌原发灶组织与转移灶组织，其中组织块较大的5例用于qRT-PCR与Western blot实验，其余10例用于免疫组化实验。上述15例患者手术时间为2016年1月至2016年12月，所有患者均为HBV病毒阳性。其中，肿瘤分期为Ⅱ期的3例，Ⅲ期的8例，Ⅳ期的4例。患者均未在术前进行过放疗或化疗治疗。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 qRT-PCR 首先，利用购自OMEGA公司的商品化组织RNA提取试剂盒(货号R6834-01)对5对肝癌原发灶与转移灶组织中RNA进行提取，用购自Takara公司的商品化反转录试剂盒(货号RR047A)将所提mRNA反转录为cDNA。用Sybgreen染料掺入法最终对各原发与转移灶组织中MiD51的mRNA表达水平进行实时定量聚合酶链反应(PCR)检测。PCR引物序列为：上游5'-TCCATCAATTGGCCAGCCAT-3'，下游5'-TTTGGCCACCAAGACTGTGT-3'。内参基因GAPDH的PCR引物序列为：上游5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游 5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。用 2-△△Ct法对各原发与转移组织中MiD51的相对表达进行计算。

1.2.2 Western Blot 用组织研磨器对-80℃冰箱保存的5对肝癌原发灶与转移灶组织进行充分研磨，之后加入适量的RIPA裂解液(含蛋白酶与磷酸酶抑制)，将细胞充分混匀于裂解液中并置于冰上裂解30 min，随后将细胞裂解产物于4℃离心机中以13 000 r/min转速离心30 min，小心吸取裂解液上清即获得细胞总蛋白。用蛋白质定量(BCA)法对所提取各组细胞蛋白浓度进行检测，加入5倍的上样缓冲液并在沸水煮沸5 min，待蛋白自然冷却后即可将各组蛋白样品用移液器加样至事先配好的聚丙烯酰胺凝胶中并进行电泳分离。电泳第一步用90 V电压，溴酚蓝由上层胶电泳入下层胶后，改变电压为120 V并继续电泳至溴酚蓝距胶底部约0.5 cm处关掉电源。将电泳过的凝胶与聚偏二氟乙酸(PVDF)膜按顺序夹好，用100 V电压转移1 h，将凝胶分离的蛋白转至PVDF膜表面。将PVDF膜用镊子小心夹住一角放入5%脱脂牛奶中并于摇床上缓慢振荡封闭1 h，分别加入购自Abcam公司商品化的MiD51(货号ab)与购自Cell Signaling公司的β-actin内参抗体(货号4967S)，4℃孵育过夜，之后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜3次(每次6 min)，滴加稀释过的人触珠蛋白相关蛋白(HRP)标记二抗(货号ab6721)室温孵育2 h，PBS洗膜3次(每次6 min)。最后，将发光液(货号WBKLS0050，Millipore公司)滴加至PVDF膜并在ECL成像系统中对结果进行分析观察。使用Quantity One软件对Western blot条带灰度进行扫描。

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