胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，我国胃癌发病和死亡病例大约是全球的45%[1]。因确诊时多为晚期，错过最佳手术根治时机，晚期胃癌主要治疗方法是新辅助放化疗、分子靶向治疗和免疫治疗相结合[2]。研究胃癌的分子靶点，对胃癌靶向治疗极为重要。

研究表明，miRNA(micro RNA)的异位表达在胃癌增殖、迁移、侵袭和凋亡都具有重要作用，是胃癌诊断和治疗的潜在生物标志物[3]。有研究应用微阵列芯片技术比较胃癌与癌旁正常组织miRNA差异表达谱发现，在胃癌组织中miR-660-3p表达下调，且其可能参与胃癌发生的调控，是潜在的胃癌标志物[4]，但目前miR-660-3p对胃癌细胞的影响及其机制尚不清楚。miR-660-3p和miR-660-5p均是miR-660的成熟miRNA。本研究通过TargetScan预测发现，REG4(Regenerating islet-derived family member 4)可能是miR-660-3p的靶基因。REG4是胃癌的一个诊断标志物，研究发现REG4在胃癌患者中高表达[5]。高表达REG4与胃癌晚期和不良预后相关，REG4过表达可通过增加粘附能力显著增强腹膜转移[6]，并有研究证明体外干扰REG4表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡[7]，而miR-660-3p和REG4两者在胃癌中的作用机制和关系尚不清楚。

本课题以人胃癌细胞系MGC-803为研究对象，探讨胃癌细胞中miR-660-3p靶向REG4调控对癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 选取本院2015年6月至2017年12月手术切除经病理检查确诊为胃癌的胃癌组织标本和癌旁正常组织(与癌组织临近且>1.5 cm)各134例，患者年龄21～72岁，平均年龄(47.)岁，组织标本切除前患者均未进行放化疗等。所有标本用途均与患者说明，并与患者签订知情同意书。

1.1.2 试剂和仪器 人胃癌细胞株MGC-803购自北京北纳生物；牛血清白蛋白(Bovine Serun Albumin,BSA)、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和四氮唑蓝(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司；Transwell板购自美国Corning公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂、RNA提取试剂TRIzol、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司；引物、miR-660-3p模拟物(miR-660-3p)、抑制剂(anti-miR-660-3p)、REG4的过表达载体()、空载体和阴性对照(miR-NC和anti-miR-NC)及双荧光载体的构建购自上海吉玛制药有限公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；REG4抗体、CyclinD1抗体、p21抗体、E-cadherin抗体、MMP-2抗体和GAPDH抗体购自英国Abcam；显微镜、酶标仪、发光仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将胃癌MGC-803细胞培养于含10% FBS、1% 青霉素-链霉素的RPMI-1640培养液中，置于饱和湿度，37 ℃ 5% CO2培养箱培养，细胞生长至对数生长期，消化传代。

1.2.2 细胞转染 将MGC-803细胞接种在6孔板中(2×l05个细胞/孔)培养，当细胞融合为一层时进行转染。根据转染试剂说明书进行操作，用无血清培养液稀释脂质体Lipofectamine 2000和各组载体，转染培养好的MGC-803细胞，培养6 h，弃培养液，换成RPMI-1640培养基，转染48 h，收集细胞，验证转染效果，进行后续实验。转染分组：miR-660-3p过表达组(转染miR-NC和miR-660-3p)；miR-660-3p抑制组(转染anti-miR-NC和anti-miR-660-3p)；miR-660-3p和REG4同时过表达组(转染miR-660-3p+pcDNA3.1和miR-660-3p+)及双荧光素酶报告系统组(转染WT-REG4+miR-NC，WT- REG4+miR-660-3p，MUT-REG4+miR-NC和MUT-REG4+miR-660-3p)。

1.2.3 qRT-PCR检测miR-660-3p的表达 用TRIzol试剂提取胃癌组织、癌旁组织及MGC-803细胞总RNA，然后以RNA为模板根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，测定浓度和纯度，以cDNA为模板，按照 real-time PCR试剂盒的说明书进行反应，扩增miR-660-3p。反应程序为：95 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。运用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4 MTT实验检测细胞增殖 将转染后的MGC-803细胞接种于96孔板中(2×103个/孔)，继续培养，分别在24 h、48 h和72 h时每孔加入 20 μL(5 mg/mL)MTT溶液，培养4 h后弃培养上清，加入150 μL DMSO，室温振荡5 min溶解甲臜结晶，酶标仪检测波长490 nm处吸光度值。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

(1)迁移实验：将MGC-803细胞在含10 g/L BSA的无血清RPMI-1640培养基中饥饿培养过夜，然后稀释为2×105个细胞/mL。取100 μL稀释的MGC-803细胞加入Transwell上层小室，Transwell下层小室加入500 μL含10%FBS的培养基作为迁移趋化物，置培养箱培养24 h，取出小室后用棉签拭去上层小室未迁移的细胞，甲醇固定迁移细胞，结晶紫染色，显微镜计数5～10个视野，取平均值。

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