胃癌是全球第四大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的第二大原因[1], 其中大半发生在东亚，尤其是中国[2]。大多数胃癌患者在晚期才被诊断出来，预后差，5年生存率低[3]，其中一个影响原因是缺乏有效的早期诊断生物标志物。因此，研究胃癌的分子机制，确定早期诊断的生物标志物和更有效治疗的新靶点是十分必要的。

Micrornas (miRNAs)是长度为19～24个核苷酸的小的非编码RNA，其通过直接靶向3′-非翻译区(3′-UTR)来抑制翻译或促进靶mRNA的降解[4]。 越来越多的证据表明异常miRNA在包括胃癌在内地多种人类癌症的发生和发展过程中起着致癌基因或肿瘤抑制因子的作用[5-7]。 例如， miR-21在胃癌中过表达并通过负调节重要的肿瘤抑制基因如PTEN，PDCD4和RECK促进肿瘤增殖和侵袭[8-10]，miR-148b-3p通过抑制Dock6/Rac1/Cdc42轴抑制胃癌转移[11]。然而， miR-515-5p在胃癌中的调控作用和分子机制尚不是非常明确。因此，本文旨在研究miR-515-5p是否可以在胃癌细胞中调节Wnt3的表达进而调控胃癌的进展。

1材料与方法

1.1 材料

采集了2016年4月至2017年5月在广西壮族自治区南溪山医院接受肿瘤切除的60例患者的胃癌组织和邻近正常组织样本。 招募到本研究的患者均未接受任何术前治疗。手术切除后，立即将标本冷冻于液氮中，并于-80 ℃保存，以作进一步分析。本研究得到了广西壮族自治区伦理委员会的批准，并获得了所有患者的知情同意。

使用的人胃癌细胞株MGC-803，BGC-823，HGC-27和SGC-7901细胞系均购自上海中国科学院细胞库。人正常胃上皮细胞系(GES1)购自American Type Culture Collection。RPMI-1640基础培养基、胎牛血清购于Gibco公司。miR-515-5p阴性对照(NC mimic)或模拟物(miR-515-5p mimic)转染试剂，Wnt3质粒购自广州锐博公司。Lipofectamine 2000、Trizol试剂、M-MLVRT逆转录试剂盒、SYBR?Green qPCR SuperMix试剂盒购自美国Invitrogen公司，SYBR?Green PCR Master Mix购自日本Toyobo公司。CCK-8试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司。transwell试剂盒购自美国Corning Costar公司。一抗抗体Wnt3，E-cadherin，N-cadherin及GADPH 抗体均购自美国Abcam公司。双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养细胞。所有培养基均添加青霉素100 U/mL和链霉素100 lg/mL，细胞保存于37 ℃、5% CO2的湿化培养箱中。

1.2.2 细胞转染 使用Lipofectamine 2000转染试剂，根据说明书以40 nmol/L每个细胞的浓度转染miR-515-5p模拟物(miR-515-5p mimic)，抑制物(miR-515-5p inhibitor)或相应的对照物(NC mimic，NC inhibitor)。Wnt3过表达质粒()和对照质粒()，并且2 μg的质粒通过Lipofectamine 2000转染至每个细胞。采用qRT-PCR和蛋白免疫印迹法检测转染效率。

1.2.3 qRT-PCR 根据说明书用Trizol试剂从培养的细胞中提取总RNA。用M-MLVRT逆转录试剂盒合成cDNA。利用SYBR?Green PCR Master Mix扩增cDNA。采用SYBR?Green qPCR SuperMix检测mRNA水平。以U6 和GAPDH分别作为miR-515-5p和Wnt3的内参基因。使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。引物序列为：miR-515-5p, 5′-GCTTCGGTTAATGCTAATCGTG-3′(上游)， 5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′(下游)；Wnt3：forward, 5′-CCACAACACGAGGACGGAGA-3′(上游)，5′-CGCCCAGCCACACACTTC-3′(下游)；U6： 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游), 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游)；GAPDH：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′ (上游)，5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′(下游)。

1.2.3 细胞增殖实验 采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)，按照说明将2 000个细胞接种到96孔板中，孵育24 h、48 h、72 h、96 h。加入 CCK-8试剂后，孵育2 h。使用分光光度计在450 nm波长(OD值)下的吸光度，平均OD值用于估计各组细胞数。

1.2.4 细胞侵袭实验 通过使用具有8 mm孔径的Transwell小室测定细胞的侵袭能力。将Transwell小室放入24孔板中。 首先，我们将0.1 mL 基底膜基质(Matrigel，50 μg/mL)加到板表面上并孵育2 h。 将100 μL细胞悬浮液(1×105个细胞)悬浮于不含胎牛血清的RPMI 1640中，然后加入每个用Matrigel包被的插入物的上室中。 接下来，将500 μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640加入下室中。 将细胞在5% CO2湿润的培养箱中温育24～48 h。 温育后，用95%乙醇洗涤细胞并用结晶紫染色。通过棉签除去上表面上的细胞，在光学显微镜下拍照，并对侵入底部表面的细胞进行计数。

1.2.5 Western blot实验 转染后从细胞中分离出总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，并按照说明进行检测。样品经12% SDS-PAGE电泳。然后将蛋白转移到PVDF膜上。在脱脂乳中封闭后，用特定的一抗Wnt3，GAPDH (1∶1 000)在4 ℃中孵育过夜。然后将印迹膜与HRP标记的抗小鼠IgG(1∶2 000)抗体在室温下孵育2 h。利用增强化学发光(ECL)检测系统观察蛋白质。GAPDH作为内参。

上一篇：桂皮醛通过TGF-beta信号通路调控结直肠癌细胞
下一篇：没有了