脑胶质瘤是中枢神经系统常见恶性肿瘤，其具有高病发率与高致残率等特点，临床主要采用放疗或化疗手段进行治疗，但肿瘤细胞异常增殖及转移导致该疾病恶性进展，患者预后较差[1,2]。因而寻找新的治疗方法对延长患者生存时间及提高生活质量均具有重要意义。右美托咪定属于α2-肾上腺受体激动剂，研究表明右美托咪定具有抗氧化应激、抗癌等作用，并可抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭[3，4]。但右美托咪定对胶质瘤发生发展过程的影响尚未可知。微小RNA-760(microRNA-760，miR-760)在胃癌中呈低表达，上调miR-760的表达可抑制细胞迁移及侵袭[5]。TargetScan靶基因网站预测显示肝癌衍生生长因子(hepatoma derived growth factor，HDGF)可能是miR-760的靶基因，研究报道指出miR-760在胶质瘤、胃癌中呈高表达，抑制miR-760的表达可减弱肿瘤细胞增殖能力[6，7]。但miR-760是否可通过调控HDGF影响胶质瘤细胞生物学行为尚未可知。目前关于右美托咪定是否通过调控miR-760/HDGF信号通路而发挥抗胶质瘤作用尚未可知。本研究以脑胶质瘤细胞A172为研究对象，探讨右美托咪定对A172细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的作用及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

右美托咪定购自湖北信康医药化工有限公司。人脑胶质瘤细胞A172购自上海酶研生物科技有限公司。DMEM培养基、胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)、胰蛋白酶均购自美国Thermo Fisher公司；RIPA裂解液购自陕西碧云天生物工程有限公司；二 喹 啉 甲 酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒与增强型化学发光试剂(electrochemiluminescence，ECL)购自美国Pierce公司；miR-760模拟物(mimics)及其阴性对照(miR-con)、miR-760特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-760)及其阴性对照(anti-miR-con)均购自广州锐博生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自上海恒斐生物科技有限公司；Trizol试剂购自北京百奥莱博科技有限公司；反转录试剂与SYBR荧光定量试剂均购自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自武汉艾美捷科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自上海润成生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；兔抗人HDGF抗体购自；兔抗人基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、细胞凋亡的标志蛋白PARP降解产物(cleaved PARP)抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验处理与分组 胶质瘤细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养，每隔2 d更换培养液，细胞传代培养。取对数生长期胶质瘤细胞，用不同浓度(50、100、200、400、800 mg/L)的右美托咪定处理细胞24 h，分别命名为右美托咪定 50、右美托咪定100、右美托咪定200、右美托咪定400 mg/L组，同时将正常培养的细胞作为空白组。miR-760调控HDGF基因表达，实验分组：miR-con组(miR-con转染至胶质瘤细胞)、miR-760组(miR-760 mimics转染至胶质瘤细胞)、anti-miR-con组(anti-miR-con转染至胶质瘤细胞)、anti-miR-760组(anti-miR-760转染至胶质瘤细胞)，转染前1 h将培养液更换为不含血清的DMEM培养基，转染6 h后将培养液更换为含有血清的DMEM培养基，继续培养48 h后收集细胞。miR-760过表达及干扰miR-760的表达对胶质瘤细胞生物学行为的影响，实验分组：miR-con组、miR-760组、右美托咪定+anti-miR-con组(anti-miR-con转染至胶质瘤细胞48 h，含有400 mg/L 右美托咪定的培养基培养24 h)、右美托咪定+anti-miR-760组(anti-miR-760转染至胶质瘤细胞48 h，含有400 mg/L 右美托咪定的培养基培养24 h)。

1.2.2MTT检测细胞增殖 取对数生长期胶质瘤细胞，0.25%胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔板(100 μL/孔)，按照“1.2.1”分组，每组设置3个复孔，转染48 h后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，置于振荡仪匀速振荡10 min，应用酶标仪检测波长为490 nm处各孔吸光度值，计算细胞存活率。每组设置3次重复。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组胶质瘤细胞，室温条件下1 000 r/min转速离心6 min，预冷PBS洗涤，加入500 μL结合缓冲液，加入5 μL膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)与5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

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