0 引言 Introduction

周围神经缺损是临床创伤骨科常见病症，有较高的致残率。自体神经移植是一种效果较好的修复周围神经缺损的方式，但这种手术方式存在一些问题，会造成新的神经损伤，可提供移植的神经来源有限，还有增加新的创伤等。后来有些学者用异体神经、羊膜、动静脉等材料桥接修复周围神经缺损，但没有得到满意的实验效果。于是人造材料开始成为神经导管的研究方向，其中较热门的就是可降解的人造高分子材料。

随着组织工程学及基因工程学的高速发展，神经组织支架已成为组织工程化神经中最基础、最重要的组成部分[1]，即把周围神经损伤断端用神经支架导管桥接修复，从而提供损伤神经再生的通路；同时合适的神经营养因子和引导环境能满足神经再生的需要，促进神经的生长和修复。而随着神经营养因子的发现，近年来对周围神经缺损修复的研究已经由解剖学连续性向生物学修复治疗转变，各种生物修复材料不断发展[2-4]。其中，脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)是中枢及周围神经系统的重要营养因子[5-6]，它可以通过神经肽的表达来保持细胞内钙离子的平稳状态；能通过对抗自由基的损伤，增加细胞内抗氧化酶的活性及刺激细胞的修复；还可以通过调节细胞膜上钙通道蛋白的表达而影响钙离子流，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，而且能促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。但BDNF 作为一种活性蛋白的稳定性较差，在水溶液中易失活，而且易受酸碱酶的破坏。为解决上述问题，将其制成缓释微囊以达到长期释药的效果。“生物微囊”是通过将酶、蛋白质和激素等生物活性物质包封在选择性透过膜中，通过微囊膜的选择透过作用发挥良好的缓释、控释和靶向递药特性[7]。

实验采用乳化-溶剂挥发法与聚合物合金法制备BDNF缓释微球[8-9]，并将微球注入到几丁糖/聚乙烯醇导管内桥接修复周围神经缺损，观察其促进神经再生的作用。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照，动物实验观察。

1.2 时间及地点 于2018 年8 月至2019 年4 月在河北医科大学第二医院动物实验室完成。

1.3 材料 几丁糖/聚乙烯醇神经导管(上海其胜生物制剂有限公司)；BDNF(北京康肽生物科技有限公司)；聚乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (北京化学试剂公司)；几丁糖(上海其胜生物制剂有限公司)；聚乙烯醇PvA-124(北京化学试剂公司)；牛血清白蛋白(北京奥博星生物技术责任有限公司)；二氯甲烷(北京化学试剂公司)；双通道肌电图仪(Medtronic KeyPoint，丹麦)。

实验动物：选用健康成年雄性SD 大鼠60 只，体质量250-300 g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2018-004。动物实验获得河北医科大学第二医院科研伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 几丁糖/聚乙烯醇导管的制备[10]配制 2%的几丁糖溶液，利用 1%NaOH 溶液调整pH 值至9.0-10.0 之间，先搅拌均匀，后静置脱泡，再加入少量 2%双缩水甘油醚，再次搅拌均匀后置入50 ℃恒温水域中反应 20-24 h；然后加入聚乙烯醇，使其与壳聚糖的质量比为 2 ∶3，混合均匀、脱泡后，加入到神经导管模具中，置入-20 ℃冰箱中深冻，再取出，室温下融化后再深冻，如此步骤反复四五次；最后一次融化后将凝胶柱取出，利用旋转干模设备于室温下旋转风干，再用蒸馏水中浸泡 30 min，自动脱模，然后分别在不同的时间更换新鲜蒸馏水，从而去除残留的交联剂和碱性物质，再风干，修剪，60Co 照射灭菌，最后形成内径 1.5 mm、壁厚 0.3 mm、长度 2.0 cm 的神经导管，使用前用生理盐水浸泡2 h。

1.4.2 制备BDNF 缓释微球[8]采用乳化-溶剂挥发法(S/O/W)与聚合物合金法制备BDNF 缓释微球[9]，分为2 步：

(1)BDNF 微粉化：牛血清白蛋白溶液0.5 mL(含牛血清白蛋白10 mg)与纯化的BDNF 300 μg 混合后行冻干处理，设定温度-50 ℃，降温速度20 ℃/min，设定冻干条件(-20 ℃3 h；20 ℃12 h)。将混合物冻干后获得均匀分布于牛血清白蛋白基质中的BDNF 药粉(S)。

(2)BDNF 微囊化：聚乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(聚乳酸∶聚乳酸-羟基乙酸共聚物=1 ∶3)300 mg 放入试管内，加入所制BDNF 冻干粉和2 mL 的二氯甲烷使聚合物溶解成为油相(O)。2%聚乙烯醇溶液10 mL(W) 是水相。将2%聚乙烯醇溶液10 mL(W)加入油相(O)中，再高速匀浆30 s，就形成S/O/W 乳液， 然后在400 mL 10%的去离子水氯化钠溶液中倒入复乳，再在室温下磁力搅拌，1 700 r/min 搅拌2 h，前半小时冰浴，再800 r/min 搅拌2 h 挥发残余有机溶剂，收集微球，去离子水洗涤3 遍，真空冻干，得微球260 mg，置于4 ℃保存。

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