原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是消化系统常见恶性肿瘤，在我国肿瘤病死率仅次于肺癌、胃癌，位居第3 位[1-2]。肝癌术后患者易出现转移、复发，导致其死亡率高，且术后治疗效果不理想，该病已成为严重社会负担[3-5]。究其原因，临床尚缺乏防治肝癌转移复发的有效方法，即未找到确切的药物作用靶点。研究表明，钙激活中性蛋白酶（calcium activated neutral protease，CANP 或Calpain）在一些肿瘤细胞浸润迁移中发挥重要作用[6]。其中Calpain-2（也称m-calpain）被证实与多种肿瘤细胞侵袭迁移密切相关[7-10]。Calpain活性受抑制剂ALLM和Ca2+浓度的调控，在细胞的各个生命活动中，调控异常将给细胞带来致命的损害。鸡肉瘤病毒基因组中的基因（sarcoma gene，Src）是最早报道的癌基因，在肿瘤的发生、发展和转移中具有重要作用[11]。本研究通过使用特异性抑制剂ALLM抑制Calpain-2 的活性，观察不同转移能力肝癌细胞侵袭、迁移能力及Src基因表达变化，为探索肝癌药物治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2 和正常人肝细胞HL-7702 购于中国科学院上海生命科学院细胞库；ALLM 由 invitrogen 公司提供；兔抗 SRC（N535）抗体由美国BioworldTechnology公司提供。

1.2 方法 实验分为对照组、抑制剂组，常规方法培养MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2 和正常人肝细胞HL-7702，ALLM抑制剂的浓度1×10-3mol/L，高浓度处理各细胞系72 h，用Western blot检测肝癌细胞系Src的表达，划痕实验、Transwell实验检验肝癌细胞系的迁移、侵袭能力。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALLM对转移性肝癌细胞迁移能力的影响 与O h处理比较，可见转移性肝癌细胞系（MHCC97-H、MHCC97-L）发生明显的迁移（P＜0.01），与对照组比较，给予高浓度ALLM 处理72 h 后，转移性肝癌细胞系（MHCC97-H、MHCC97-L）迁移距离明显缩小，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MHCC97-H抑制作用更显著（P＜0.01），见图1。

图1 ALLM对转移性肝癌细胞迁移能力的影响Figure 1 Effect of ALLM on the migration ability of metastatic liver cancer cells注：**P＜0.01，*P＜0.05

2.2 ALLM对肝癌细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验结果表明，与正常肝细胞比较，肝癌细胞系（MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2）的穿膜细胞吸光度OD 值比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，高浓度ALLM 处理72 h的转移性肝癌细胞（MHCC97-H、MHCC97-L）穿膜细胞的吸光度OD 值差异有统计学意义（P＜0.05）。MHCC97-H 抑制更明显（P＜0.01），见图2。

2.3 ALLM 对Src 表达的影响 与正常肝细HL-7702 比较，转移性肝癌细胞Src 的表达显著增高（P＜0.05），不转移肝癌细胞Src 的表达差异无统计学意义。高浓度ALLM 处理（MHCC97-H、MHCC97-L）72 h后，结果发现，与对照组比较，Src的表达减少明显，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图3。

图2 ALLM对肝癌细胞侵袭能力的影响Figure 2 The effect of ALLM on the invasion ability of liver cancer cells注：**P＜0.01，*P＜0.05

图3 ALLM 对Src表达的影响Figure 3 Effect of ALLM on Src expression注：A，Western blot图；-为对照组，+为ALLM处理72 h

3 讨论

肝癌的侵袭转移是导致患者治疗效果不佳和死亡率高的重要因素之一，同时也是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。研究表明，Calpain是细胞迁移中一个重要信号转导体，不仅参与细胞凋亡、增殖和蛋白质重整反应，而且与细胞粘附和迁移密切相关，可作为抑制肿瘤恶性生物学行为的一个潜在治疗靶点[7，10，12]。前期研究结果显示，在肝癌细胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2中Calpain的家族成员Calpain-2 的表达显著升高，提示Calpain-2 可能参与肝癌细胞的恶性行为[13-14]。研究表明用高浓度ALLM（1×10-4moL/L）处理MHCC97-H 72 h 后，Calpain-2 的表达明显下调，对肝癌细胞的生物学行为产生影响。本实验通过使用高浓度ALLM 后，不同转移能力肝癌细胞系与不转移及正常肝细胞比较侵袭迁移能力明显下降；同时，对Src 原癌基因的表达产生下调作用。

原癌基因的异常激活或抑癌基因的异常失活在肿瘤的发生发展中起关键性作用，Src 是一种原癌基因，属于蛋白酪氨酸激酶家族的成员之一。研究表明，高度活化的Src基因在肿瘤的发生发展中具有很强的细胞转化能力，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，是导致多种肿瘤恶性程度增高的关键因素之一[15]。Calpain 是侵袭伪足形成所必需的蛋白因子，整合素和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）介导的细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）途径可使 Calpain-2 水解，使得Calpain-2 活性增强并剪切蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B），PTP1B 剪切产物被磷酸酶激活，使Src529肽链位上酪氨酸（Y529）去磷酸化，从而激活Src[11，16]。本研究发现，经高浓度的抑制剂处理后，转移性肝癌细胞系的侵袭、迁移能力明显下降，Src 蛋白表达减少，这可能是ALLM 抑制Calpain-2 活性，间接导致Src活化减少或抑制，从而抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。有研究发现，Calpain-2 可调节Src 基因的上游和下游的功能区从而调节侵袭伪足的生成及运动[11，16]。细胞膜皮质部去磷酸化的Src 通过促进球形肌动蛋白组装成丝状的肌动蛋白能诱导肿瘤细胞向前迁移，使得细胞骨架向前方伸展，并将细胞推进前方，形成侵润伪足，激活Calpain-2 后使侵袭伪足解体，细胞膜向细胞内缩，另一边伸展，从而导致细胞发生迁移运动[11，17-18]。本实验抑制Calpain-2 活性后，转移性肝癌细胞的侵袭、迁移能力明显下降，其作用机制可能为ALLM 抑制Calpain-2 活性，导致Src 基因的转录受到抑制，从而使Src基因表达产物下降，导致细胞伪足生成减少及细胞膜运动能力减弱，出现侵袭迁移能力下降。

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